菌株的概念分類和保存

1 菌株的慨念分類

1.1、概念

標準菌株：即0代菌種，是指從菌種保藏機構獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株。

標準儲備菌株：從國內或國外菌種保藏機構獲得的標準菌株經過復活并在適宜的培養基中生長后，即為標準貯備菌株。

儲存菌株：儲存菌株通常從凍干或超低溫保存的標準儲存菌株進行制備。

工作菌株：標準儲備菌株或儲存菌株經繼代培養后得到的菌株。工作菌株不可替代標準菌株。

標準培養物：標準菌株、標準儲備菌株、工作菌株的統稱。

商業派生菌株：與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業衍生物。

1.2、商業派生菌株

商業派生菌株是標準菌株的商業衍生物，最常見的商業派生菌株有廣東環凱的定量工作菌株。在中國藥典2015版9203指導原則里面有提到“藥品微生物檢驗用的試驗菌應來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業派生菌株"，也有關于可以使用合格的商品化菌株的描述“Cultures for use in compendial tests should be acquired from a national culture collection or a qualified secondary supplier"。隨著技術的進步與發展，微生物實驗室穩定、高效的需求，用于質控的商業化定量工作菌株的廣泛應用定是必然趨勢。

商業派生菌株要求相關特性與標準菌株等效，除此之外，還有關鍵一點就是“可以溯源"。微生物"溯源"通常包含兩層意思，一是指程序、途徑合法有序，來源和去向清晰可控；另外是技術層面的佐證，比如株水平的鑒定識別等。這兩個層面互為補充支撐，以保證菌種準確無誤、合法有效。

2 菌株的保存

2.1、 常用保存方法

短期保存：營養瓊脂斜面法 (4°C)

步驟：
? 將新鮮培養物劃線或穿刺接種于無菌營養瓊脂斜面。
? 于合適溫度（通常37°C）培養至良好生長（通常16-24小時）。
? 斜面長出新鮮菌苔后，旋緊試管蓋或用無菌膠塞密封（確保透氣）。
? 貼上標簽（菌株編號、日期、操作人），置于4°C冰箱。

保存期： 1 - 3個月（因菌種差異極大）。

優點： 操作簡單、復蘇快。

缺點： 易污染、易變異、保存時間短、需頻繁傳代。

關鍵點： 使用新鮮培養物；密封防干涸；定期檢查存活狀態。

中長期保存：甘油冷凍管法

步驟：
? 制備50%無菌甘油溶液（用去離子水或生理鹽水配制，121°C滅菌15分鐘）。
? 取對數生長后期的新鮮肉湯培養物（OD~600~ ≈ 0.6 - 1.0）或適量無菌生理鹽水菌懸液。
? 將菌懸液與50%甘油溶液等體積混合（終甘油濃度~25%）。或直接將菌苔刮入含滅菌甘油的成品管（如下圖的環凱甘油保存管）中混勻。

? 分裝至無菌、預標記好的冷凍管（如1.5ml或2ml Cryovial管）中（通常0.5 - 1ml/管），立即置于超低溫冰箱保存。

保存期： 1 - 10年或更長（視菌種而定）。

優點： 保存時間長、操作相對簡單、遺傳穩定性較好、復蘇率高。

缺點： 依賴超低溫C冰箱、復蘇需解凍。

關鍵點： 確保菌體處于對數生長期（活力最佳）；甘油濃度準確（過高抑制，過低冰晶損傷）；混合均勻；快速冷凍（可先放-20°C 1-2小時再轉-80°C）；避免反復凍融。

長期保存：冷凍干燥法（凍干法）

步驟 (簡述)：
制備保護劑：常用脫脂牛奶、蔗糖、海藻糖等。
制備濃菌懸液：取新鮮培養的菌苔，懸浮于適量保護劑中（濃度約10⁸-10¹⁰CFU/ml）。
分裝：將菌懸液分裝至無菌凍干安瓿瓶中（0.2 - 0.5ml）。
預凍：將安瓿瓶置于-40°C至-80°C快速預凍。
冷凍干燥：將預凍好的樣品放入凍干機，在真空下升華除去水分（通常需數小時至數十小時）。
封口：凍干結束后，在真空或充氮氣條件下用火焰熔封安瓿瓶。
儲存：將封口后的安瓿瓶置于4°C或-20°C避光干燥處長期保存。

保存期： 10 - 30年或更長。

優點： 保存時間極長、遺傳穩定性好、占用空間小、便于運輸。

缺點： 設備昂貴、操作復雜、成本高、部分菌種復蘇率可能較低。

關鍵點： 保護劑選擇與滅菌；菌懸液濃度；預凍速度；凍干程序優化；嚴格無菌操作；安瓿瓶封口質量。

2.2、通用操作規范與注意事項

1. 無菌操作： 所有步驟必須在無菌條件下進行（超凈工作臺/生物安全柜）。

2. 菌株狀態： 使用新鮮、對數生長期、純培養物進行保存。保存前需確認純度（鏡檢、平板劃線）。

3. 標簽標識：清晰標注菌株編號、保存日期、保存人姓名、保存方法。
      使用防水、耐低溫的標簽和記號筆。
      冷凍管標簽應能耐-80°C低溫。

4. 記錄管理： 建立詳細的菌種保存登記本或電子數據庫，記錄保存信息（菌株信息、保存方法、位置、數量、復蘇記錄等）。

5. 備份原則： 重要菌株應至少采用兩種不同方法保存（如甘油管+凍干），并分置于不同地點（如同一冰箱不同層或不同冰箱），防止設備故障導致全部損失。

6. 避免反復凍融： 冷凍保存的菌株（甘油管、凍干粉、液氮管）一旦解凍復蘇，不得再次冷凍保存。應重新從原代保存管取菌培養后進行新一輪保存。

7. 定期檢查：
      4°C斜面：每周檢查有無污染、干涸。
      -80°C冰箱：記錄溫度，定期除霜維護。每年抽樣復蘇檢查代表性菌株。