新版GBT16294要求：沉降菌用培養(yǎng)基暴露時間確認方案

新版GB/T 16294-2025《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌的測試方法》對沉降菌培養(yǎng)皿暴露時間提出了新要求，明確需確認單個培養(yǎng)皿的最佳暴露時間，且暴露時間一般不超過4小時，同時補充了培養(yǎng)基促生長能力的驗證要求；相較于舊版，新版不再允許簡單將短時間暴露結(jié)果換算為4小時結(jié)果，需通過試驗確定適宜的暴露時長，以避免因培養(yǎng)基脫水、菌落生長競爭等因素導(dǎo)致檢測結(jié)果失真，確保沉降菌監(jiān)測數(shù)據(jù)的準確性和代表性。以下為具體方案：

1.確認目的

確認沉降菌監(jiān)測用培養(yǎng)基在0.5小時、2小時、4小時暴露時間下，外觀無異常且仍具備良好的促生長能力，且在經(jīng)過5天的培養(yǎng)后，培養(yǎng)基仍然符合《中華人民共和國藥典2025年版四部通則1105》及GB/T 16294-2025《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌的測試方法》要求，為沉降菌監(jiān)測提供可靠的培養(yǎng)基暴露時間依據(jù)。

2.確認依據(jù)

2.1《中華人民共和國藥典2025年版四部通則1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法》
2.2 GB/T 16294-2025《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌的測試方法》

3.適用范圍

本方案適用于沉降菌監(jiān)測用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）在規(guī)定暴露時間下的性能確認，涵蓋外觀質(zhì)量及培養(yǎng)基適用性驗證。

4.試驗材料與設(shè)備

4.1培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），每皿傾注量為15ml（藥典要求15-20ml，本次確認采用最不利條件，選擇15ml進行確認），符合《中華人民共和國藥典2025年版四部》要求。

4.2試驗菌種：

采用《中華人民共和國藥典2025年版四部通則1105》規(guī)定的5種標準菌株，傳代次數(shù)不超過5代：
1）金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003
2）銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC(B)10104
3）枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63501
4）白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(F)98001
5）黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F)98003

4.3主要設(shè)備：

1）潔凈培養(yǎng)箱（30~35℃、20~25℃）
2）壓力蒸汽滅菌器
3）生物安全柜、超凈工作臺
4）菌落計數(shù)器
5）無菌培養(yǎng)皿（直徑90mm）
6）溫濕度計、壓差計（用于環(huán)境參數(shù)監(jiān)測）

5.確認條件

5.1測試環(huán)境：選擇公司換氣次數(shù)最大的潔凈房間，測試前凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運行不少于30分鐘，維持靜態(tài)環(huán)境（無生產(chǎn)操作），實時監(jiān)測并記錄溫濕度、壓差、換氣次數(shù)等環(huán)境參數(shù)。

5.2采樣點設(shè)置：基于房間布局及風(fēng)險評估，確定3個代表性采樣點（如房間對角線三點、氣流關(guān)鍵區(qū)域等），每個采樣點放置18個無菌培養(yǎng)皿（每皿培養(yǎng)基15ml）。

6.確認步驟

6.1培養(yǎng)基制備：按培養(yǎng)基說明書配制TSA培養(yǎng)基，121℃壓力蒸汽滅菌15分鐘，滅菌后在超凈工作臺內(nèi)傾注無菌培養(yǎng)皿，每皿控制15ml，待培養(yǎng)基自然凝固（表面平整無氣泡）后備用。同時制備同批次未暴露的培養(yǎng)基，作為菌液對照組。

6.2暴露操作：

1）按設(shè)定的3個采樣點，每個點均勻擺放18個凝固后的培養(yǎng)基，打開皿蓋使培養(yǎng)基表面完-全暴露于空氣中，記錄暴露開始時間。

2）嚴格控制暴露時間，分別在0.5小時、2小時、4小時時間節(jié)點，從每個采樣點取出6個培養(yǎng)皿，具體分組標記：
1個標記為“供試品組"，作為暴露環(huán)境的空白對照；
5個分別標記為“試驗組-金黃色葡萄球菌"“試驗組-銅綠假單胞菌"“試驗組-枯草芽孢桿菌"“試驗組-白色念珠菌"“試驗組-黑曲霉"，分別對應(yīng)5種試驗菌種；
剩余培養(yǎng)皿繼續(xù)按設(shè)定時間暴露，直至所有時間節(jié)點完成取樣。

6.3外觀檢查：暴露取樣后，立即對各時間梯度的供試品組、試驗組培養(yǎng)基進行外觀觀察，重點檢查是否存在干裂、收縮、表面不平整、水珠凝聚過多等異常現(xiàn)象，詳細記錄每個平板的觀察結(jié)果。

6.4培養(yǎng)基適用性試驗：

1）菌液制備：將5種標準菌株分別接種至適宜液體培養(yǎng)基（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30~35℃培養(yǎng)18~24小時；白色念珠菌接種沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20~25℃培養(yǎng)24~48小時；黑曲霉接種沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20~25℃培養(yǎng)5~7天），培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，用無菌生理鹽水梯度稀釋至約100cfu/ml，備用。

2）接種操作：
供試品組：取各時間梯度的供試品組培養(yǎng)基，不接種菌液，作為供試品對照；
試驗組：取各時間梯度對應(yīng)菌種的試驗組培養(yǎng)基，分別接種對應(yīng)菌液0.1ml，用無菌涂布棒均勻涂布；
菌液對照組：取未暴露的培養(yǎng)基，分別接種5種菌液各0.1ml，作為菌液濃度對照。
陰性對照組：取未暴露的培養(yǎng)基，不接種菌液作為陰性對照。

3）培養(yǎng)：

試驗組：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種后的培養(yǎng)基，置于30~35℃培養(yǎng)5天；
試驗組：白色念珠菌、黑曲霉接種后的培養(yǎng)基，置于20~25℃培養(yǎng)5天。

菌液組：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種后的培養(yǎng)基，置于30~35℃培養(yǎng)3天；
菌液組：白色念珠菌、黑曲霉接種后的培養(yǎng)基，置于20~25℃培養(yǎng)5天。

供試品組：置于30~35℃培養(yǎng)5天。
陰性對照：置于30~35℃培養(yǎng)5天。

4）菌落計數(shù)：
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種后的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，用菌落計數(shù)器分別計數(shù)各供試品組、試驗組、菌液對照組的菌落數(shù)，陰性對照組應(yīng)無菌生長。
白色念珠菌、黑曲霉接種后的培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后，用菌落計數(shù)器分別計數(shù)各供試品組、試驗組、菌液對照組的菌落數(shù)，陰性對照組應(yīng)無菌生長。

7.數(shù)據(jù)計算與可接受標準

7.1數(shù)據(jù)計算

每種試驗菌的回收率計算公式：
回收率 =（同時間點同采樣點試驗組菌落數(shù) - 同時間點同采樣點供試品組菌落數(shù)）÷ 同菌種菌液對照組菌落數(shù)
注：每組菌落數(shù)取3個采樣點對應(yīng)平板的平均值。

7.2可接受標準

外觀要求：培養(yǎng)完畢后所有暴露時間梯度的供試品組、試驗組培養(yǎng)基均應(yīng)外觀均勻、表面平整，無干裂、無收縮、無水珠凝聚導(dǎo)致的菌落蔓延現(xiàn)象。

微生物指標：
陰性對照組：平板應(yīng)無菌生長，否則試驗無效；
菌液對照組：每種試驗菌的平均菌落數(shù)應(yīng)在80~100cfu范圍內(nèi)（確保菌液濃度準確）；
試驗組：每種試驗菌的回收效率應(yīng)在0.5~2.0范圍內(nèi)。

8.結(jié)果記錄與報告

建立詳細記錄表格，記錄內(nèi)容包括：培養(yǎng)基制備信息、環(huán)境參數(shù)（溫濕度、壓差、換氣次數(shù)）、采樣點位置、暴露時間、外觀檢查結(jié)果、各組菌落計數(shù)數(shù)據(jù)、回收效率計算結(jié)果。

匯總所有數(shù)據(jù)，按可接受標準進行逐項判定，出具確認報告，明確各暴露時間下培養(yǎng)基是否符合要求。

9.確認結(jié)論

根據(jù)外觀檢查及培養(yǎng)基適用性試驗結(jié)果，綜合判定0.5小時、2小時、4小時暴露時間下，沉降菌用培養(yǎng)基是否滿足監(jiān)測要求，確定適宜的培養(yǎng)基暴露時間范圍。如2小時的滿足要求，4小時的不滿足要求，則定最佳培養(yǎng)基暴露時間為2小時。（時間達到后需要更換新的培養(yǎng)基）。

10.偏差處理

若確認過程中出現(xiàn)外觀異常、陰性對照組有菌生長或回收效率超出規(guī)定范圍，應(yīng)立即終止試驗，調(diào)查偏差原因（如培養(yǎng)基制備過程、暴露環(huán)境控制、操作污染等），采取糾正措施后重新開展確認。

11.再確認周期

當培養(yǎng)基配方變更、生產(chǎn)工藝調(diào)整、測試環(huán)境發(fā)生重大變化時，需重新進行本確認；正常情況下，每3年進行一次再確認。