從原料到奶粉，蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素如何被“揪出來”？

蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素是一種耐熱環(huán)狀肽類毒素，廣泛分布于谷物、乳制品、油脂及營養(yǎng)強(qiáng)化劑等食品中，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、耐熱性強(qiáng)、不易被常規(guī)食品加工工藝降解等特點(diǎn)。嬰幼兒配方奶粉是嬰幼兒生長發(fā)育的主要營養(yǎng)來源，生產(chǎn)過程中通常添加花生四烯酸(ARA)等功能性油脂。此類油脂原料在生產(chǎn)、儲存及復(fù)配過程中易受環(huán)境微生物污染，存在引入蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素的潛在風(fēng)險。該毒素可誘發(fā)急性e xin、嘔吐等食物中毒癥狀，而嬰幼兒機(jī)體免疫力較低，對毒素更為敏感，受害風(fēng)險更高。因此，建立靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的檢測方法，對防控嬰幼兒配方奶粉安全風(fēng)險、保障嬰幼兒飲食健康具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

目前，食品中蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素的檢測以儀器分析法為主。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)兼具靈敏度高、特異性強(qiáng)、抗基質(zhì)干擾能力好等優(yōu)勢，適用于復(fù)雜食品基質(zhì)中生物毒素的精準(zhǔn)定量檢測。本研究參照T/WSJD 57-2024《食品中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素的測定》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，以嬰幼兒配方奶粉和花生四烯酸為研究對象，采用乙腈進(jìn)行樣品提取，結(jié)合ProElut^® PLS-A 200mg/6mL(Cat.#: 65932)固相萃取柱凈化，選用迪馬科技Endeavorsil^® C18 50x2.1mm，1.8μm (Cat.#：87002)色譜柱分離，建立嬰幼兒配方奶粉和花生四烯酸中蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素的LC-MS/MS 檢測方法。

結(jié)果表明: 該方法定量限可達(dá)0.1μg/kg，樣品加標(biāo)回收率為90%~100%，方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好，符合檢測技術(shù)要求。本方法可應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉的日常風(fēng)險監(jiān)測、原輔材料質(zhì)量把控，同時可為食品安全監(jiān)管及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供技術(shù)支撐，有效保障嬰幼兒食品安全。

本方案適用于奶粉、花生四烯酸等食品中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素的測定，定量限為0.1μg/kg。

(1) 蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：濃度為100μg/mL(Cat.#: 48955)；

(2) 蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素工作液 I: 量取定量儲備液，用乙腈溶解，配置成濃度為0.1μg/mL工作液；

(3) 蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素工作液II: 量取定量工作液I，用乙腈溶解，配置成濃度為0.005μg/mL工作液；

(4) ¹³C₆-蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素內(nèi)標(biāo)儲備液：濃度為20μg/mL(Cat.#: 48956)；

(5) ¹³C₆-蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素內(nèi)標(biāo)工作液：量取定量內(nèi)標(biāo)儲備液，用乙腈溶解，配置成濃度為0.1μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液；

(6) 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確吸取相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作液和20μL內(nèi)標(biāo)工作液，用50%乙腈水定容到1mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

稱取1g樣品于15mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作液20μL，靜置30min，加5mL乙腈，渦旋混勻30s，超聲30min。8000r/min離心5min。轉(zhuǎn)移全部上清液至另一離心管中，加入5mL水，渦旋混勻30s，待凈化。

ProElut^® PLS-A 200mg/6mL(Cat.#: 65932)

(1)活化：用3mL甲醇、3mL水活化；

(2)上樣：備用液上樣，棄去流出液；

(3)淋洗：用3mL水淋洗，并用洗耳球吹掃固相萃取柱至近干；

(4)洗脫：加入5mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；

(5)重新溶解：將洗脫液在40℃水浴下氮吹至0.5mL左右，用乙腈定容至1.0mL，混勻，過0.22μm尼龍膜(Cat.#: 37177)，上機(jī)分析。

UPLC條件

色譜柱: Endeavorsil^® C18，50 x 2.1mm，1.8μm (Cat.#：87002)

流速：0.45mL/min

進(jìn)樣量：5μL

柱溫：40℃

流動相：A: 0.1%甲酸2mmol/L乙酸銨水溶液 B: 0.1%甲酸乙腈

梯度設(shè)置：

質(zhì)譜條件

電離模式: ESI

掃描方式: 正離子掃描

檢測方式: 多反應(yīng)監(jiān)測

電噴霧電壓: 5500V

霧化氣壓力: 50psi

輔助氣壓力: 50psi

氣簾氣壓力: 20psi

離子源溫度: 500℃